Lymnaea palustris -kotilon metallipitoisuuksien tutkimuksissa käytetään menetelmästandardia BIN B R21 (Naturvårdsverket 1986). Rantavesissä elävät kotilot (Lymnaea palustris) kerätään elinalueeltaan, ilman lisäaltistuksia esim. sumputtamalla. Menetelmä soveltuu melko huonosti päästöjen valvontaan, sillä kotiloihin vaikuttavat myös vanhemmat päästöt - mutta ne osoittavat hyvin päästöjen vaikutusalueen laajuuden.

1. Kotiloiden kerääminen

Rantavesissä eläneet kotilot kerättiin käsin kivisiltä, vähäkasvisilta ja aallokon vaikutuksille alttiilta rannoilta. Tutkimusajankohta ajoitetaan heinä-syyskuulle. Tuolloin veden lämpötila on useimmiten 10-15°C välillä, mikä on tutkimuksen kannalta suotuisinta. Kotilot keräävät nimittäin metalleja enemmän itseensä mitä lämpimämpää vesi on. Jokaiselta havaintoasemalta kerättiin 200 - 1000 kotiloa. Ne asetettiin varovaisesti keräilyseulaan, joka oli asetettu frigoliittilevylle (seula pysyy kelluvana näytteenoton ajan). Kotilot sijoitettiin tämän jälkeen 2 litran merkittyihin, happopestyihin, huuhdottuihin ja näytteenottopaikan merivedellä täytettyihin muovipurkkeihin.

Kotilot saivat tämän jälkeen olla purkeissaan jääkaappiin varastoituna vuorokauden verran, jotta niiden suolisto ja mahansisältö olisivat tyhjentyneet. Jääkaapin lämpötilaa pidetään suunnilleen samana kuin meriveden lämpötila. Vuorokauden jälkeen näytteet seulottiin ja kotiloiden eritteet huuhdeltiin pois. Kotilot siirrettiin uusiin happopestyihin muovipurkkeihin, jotka pakastettiin -20 asteessa kotiloiden tappamiseksi ja säilytystä varten.

2. Kotiloiden preparointi

Kotiloiden koko vaikuttaa ratkaisevasti siihen kuinka paljon niihin sitoutuu metalleja. Nuoremmat yksilöt (pienikokoisemmat) ottavat pääsääntöisesti enemmän metalleja itseensä kuin vanhemmat yksilöt. Kotilot pitää siksi ryhmitellä eri painoluokkiin ja analysoida pitoisuudet luokittain.

Preparointiin sovellettiin ruotsalaista standardia SS 02 81 87. Kotilot sulatuskäsiteltiin mikroaaltouunissa ja ryhmiteltiin painon ja lajin mukaan. Ne jaettiin eri painoluokkiin ja jokaisen luokan yksilömäärä laskettiin ja punnittiin. Painoluokkaan 0,05-0,14 g kuuluneet kotilot käytettiin tässä tutkimuksessa metallipitoisuuksien analysointiin. Pehmytkudokset poimittiin erikoishiotuilla muovipinseteillä ja laitettiin happopestyihin näytepurkkeihin. Poimittu materiaali punnittiin ja pakastettiin -20°C. Näytteitä pakastekuivatettiin 2 päivää tyhjiössä -50°C, jonka jälkeen näytteet punnittiin uudelleen. Näytemateriaali jauhettiin helpommin käsiteltäväksi, paperiarkkien välissä pullolla rullaamalla. Tämän jälkeen näytteet pakastettiin säilytystä varten.

0,2-0,25 grammaa pakkaskuivatettua näytettä laitettiin 3 ml typpihappoa (HNO₃) ja 2 ml rikkihappoa (H₂SO₄). Sekoitusta keitettiin happopestyssä teflonastiassa mikroaaltouunissa (Philips whirlpool, malli 626) 5 minuuttia 6 -teholla (tehoasteikko 10). Tämä käsittely liuottaa näytteen. Näytteet jäähdytettiin vesihauteessa ja laimennettiin 20 ml ionivaihdetulla vedellä (milli Q) ja ne siirrettiin happopestyihin näytepurkkeihin. Jatkokäsittelyt tehtiin vetokaapissa kontaminaatioiden välttämiseksi. Vanhat vertailunäytteet (3 kpl) kalasta ja simpukasta liuotettiin samalla tavoin ja sen lisäksi teflonpurkeista otettiin satunnaisotos. Kaikilta havaintoasemilta näytemateriaali on käsitelty ja analysoitu yhtenä replikaattina, paitsi Herruddenin ja Näsuddenin (Granholmssundet) havaintoasemilta, joiden kotilonäytemateriaali jaettiin kolmeksi replikaatiksi havaintoasemien sisäisen metallipitoisuuden vaihtelun selvittämiseksi.

3. Metallien analyysit

Ensimmäiseksi analysoitiin vertailunäytteet ja niitä käytettiin laitteiden kalibrointiin sekä varmistamaan kotiloista mitattavien arvojen luotettavuutta. Tämän jälkeen analysoitiin teflonpurkeista tehdyt satunnaisotokset (sokkotesti), siltä varalta että niissä olisi pieniä metallipitoisuuksia. Teflonpurkkien sokkotesteinä tehtiin 12 ajoa, vertailunäytteistä tehtiin 3 ajoa ja kotilonäytteistä tehtiin 2 analyysiajoa.

Jokaiselta havaintoasemalta käytettiin noin 100-400 kotilon pehmytkudoksia raskasmetallianalyyseihin. Metallipitoisuuksista saadut tulokset esitetään mg/kg kuivapainoa. Elohopeapitoisuudet analysoitiin ruotsalaisesta standardista tehtyä sovellusta noudattaen SS 01 81 75.

Tässä tutkimuksessa käytettiiin PSA-hydridigeneraattoria Merling Fluoresenssi-ilmaisimella atomiabsorptiospektrometrin sijaan. Kadmiumin, lyijyn ja arsenikin pitoisuudet määritettiin grafiittiiuunissa tehdyllä atomiabsorptiolla, ruotsalaisen standardin SS 02 81 83 mukaan. Metallit analysoidaan yksi kerrallaan sillä ne absorboivat eri aallonpituuksia erilaisen ionisoitumislämpötilan vuoksi.

Saatu tulos lasketaan seuraavan kaavan mukaan:

A= (lisätty abs)-(näyte abs) Metallipitoisuus (mg/kg kuivapaino) = [(näyte abs)* (lisätty abs(mg))* hehkutusjäännös]/ (A*punnittu näyte)

Sinkki ja kupari analysoitiin myös atomibsorptiolla, ruotsalaisen standardin SS 02 81 52 mukaan.